Ilgdzīvotības molekulāri ģenētisko pamatu izpēte Latvijas populācijā

Projekta vadītājs: LU Bioloģijas  fakultātes profesors Viesturs Baumanis

Mitohondriālās DNS (mtDNS) variabilitātes izmaiņu dzīves laikā  izpēte var sniegt fundamentālu ieskatu par novecošanās procesiem un to mehānismiem populācijā, procesiem, par kuriem uz šodienu eksistē tikai dažas ar faktiem slikti pamatotas hipotēzes. Ņemot vērā mitohondriju funkcionālā stāvokļa lielo nozīmi novecošanās procesā, ar mitohondriju darbības īpatnībām tiek saistīts ilgdzīvošanas fenomens. Vairākās pasaules valstīs pašlaik tiek intensīvi pētītas ilgdzīvotājiem raksturīgās mtDNS mutācijas un dažādu mtDNS polimorfismu saistība ar novecošanās procesu gaitu. Dažādās etniskās populācijās mutāciju raksturs ir atšķirīgs.

Pētniecības projekta mērķis un darba uzdevumi 

Šī pētniecības projekta mērķis bija izpētīt Latvijai raksturīgo iedzimto mtDNS genotipu variabilitāti ilgdzīvotājiem un noskaidrot dažādu mtDNS polimorfismu ietekmi uz novecošanās procesu norisi.

Projekta uzdevumi:

1.       Veikt Latvijas ilgdzīvotāju mtDNS hipervariablo segmentu I un II (HVS-I un HVS-II) molekulāro tipēšanu un statistisko datu apstrādi.

2.       Noteikt pētāmo indivīdu mtDNS haplogrupas, izmantojot mtDNS kodējošā rajona analīzi.

3.       Veikt mtDNS polimorfismu korelācijas analīzi dažādām vecuma grupām. 

4.       Saskaņā ar starptautiski pieņemtām un standartizētām metodēm  salīdzināt iegūtos datus ar citās Eiropas valstīs veikto pētījumu rezultātiem

Rezultāti:

Projekta ietvaros tika izanalizēti 114 paraugi no divām vecuma grupām (pirmā vecuma grupa - 98 paraugi no indivīdiem vecumā no 74-89 gadiem; otrā vecuma grupa - 16 paraugi no indivīdiem vecumā virs 90 gadiem - ilgdzīvotājiem). Tika iesākta ilgdzīvotāju DNS kolekcijas veidošana.

I. Pirmās vecuma grupas raksturojums.

mtDNS haplogrupas un haplotipi tika noteikti 98 indivīdiem vecuma grupā no 74 līdz 89 gadiem. Visiem paraugiem tika veikta mtDNS kontroles reģiona HVS-I segmenta tieša sekvenēšana. Analizējot iegūtos haplotipus, paraugi tika sašķiroti pēc to iespējamās piederības konkrētām haplogrupām. Paraugu piederība noteiktajām haplogrupām tika pārbaudīta, veicot PCR-RFLP analīzi, izmantojot 8 restriktāzes: AluI, HinfI, RsaI, NlaIII, MseI, BsuRI, BstOI un AccI. 95 no izanalizētajiem paraugiem piederēja pie astoņām dažādām Eiropas populācijai raksturīgām mtDNS haplogrupām - H, V, HV, U, I, W, T un J.

Trijiem no analizētajiem paraugiem tika konstatēti īpatnēji haplotipi un noteikta to iespējamā piederība pie R (1 paraugam), X (1 paraugam) un M (1 paraugam) haplogrupām, taču šo rezultātu apstiprināšanai nākotnē ir nepieciešams veikt minēto paraugu tālāku analīzi.

Salīdzinot vecāko indivīdu grupas analīzē iegūtos rezultātus ar kontroles grupas (299 indivīdi vecumā no 18 līdz 40 gadiem) datiem, tika konstatētas atšķirības vairāku haplogrupu sastopamībā. Tika konstatēts J un U haplogrupu relatīvā biežuma pieaugums vecāko indivīdu grupā, salīdzinot ar kontroles grupu. Turpretim, mazāks relatīvais biežums vecāko indivīdu grupā (34.7%), salīdzinājumā ar kontroles grupu (44.5%), tika novērots H haplogrupai.

49 vecākās grupas indivīdu paraugiem tika veikta arī kontroles reģiona HVS-II segmenta tieša sekvenēšana. Pirmkārt, arī šo sekvenču analīzes rezultāti tika ņemti vērā, nosakot paraugu iespējamo piederību konkrētām haplogrupām pirms RFLP analīzes. Piemēram, mutācija AàG HVS-II segmentā 00 073 pozīcijā ir raksturīga visām Eiropas populācijā izplatītākajām haplogrupām, izņemot H, HV un V. Otrkārt, HVS-II segmenta sekvenēšana tika veikta ar mērķi noteikt mutācijas 150 CàT sastopamību. Saskaņā ar literatūrā minētajiem datiem, paaugstināts šīs mutācijas biežums ir ticis konstatēts gan Japānas, gan Somijas ilgdzīvotājiem. Izanalizējot iegūtās sekvences, mutācija 150 CàT tika konstatēta 6 vecākās grupas indivīdiem (12.2%). Salīdzinot šo rezultātu ar kontroles grupas datiem, kurā mutācija 150CàT bija noteikta 18 indivīdiem jeb 6.02%, var novērot šīs mutācijas sastopamības pieaugumu vecāko indivīdu starpā. 26 vecākās grupas indivīdiem (vecums 74 līdz 89 gadi) un 40 kontroles grupas indivīdiem (vecums 18 līdz 40 gadi), izmantojot denaturējošā gradienta gēla elektroforēzes (DGGE) analīzi, tika noteikta heteroplazmija HVS-I rajonā (heteroplazmija  - divu vai vairāku dažādu mtDNS esamība vienā šūnā). Pirms DGGE analīzes HVS-I rajons tika amplificēts ar diviem dažādiem praimeru pāriem (F15989 un R16258GC; F16144GC un R16410). Optimālais DGGE režīms 307bp un 310bp garajiem HVS-I segmenta fragmentiem tika noteikts eksperimentāli: poliakrilamīda gradients no 5% uz 10%, denaturējošo vielu gradients no 40% uz 50%, 100V, 45mA, 15 stundas. Ar DGGE analīzi atklātie heteroplazmijas gadījumi tika apstiprināti un konkrētā heteroplazmiju izraisošās mutācijas vieta tika noteikta, analizējot attiecīgo paraugu HVS-I segmenta sekvences. Heteroplazmija tika noteikta sešiem vecākās grupas indivīdiem (~23%) un sešiem kontroles grupas indivīdiem (15%). Būtiski, ka, palielinoties pētāmo indivīdu vecumam, ir tendence pieaugt ne tikai heteroplazmijas sastopamībai, bet arī pozīciju skaitam, kurās heteroplazmija tiek konstatēta. Mūsu iegūtie rezultāti apstiprina heteroplazmijas augstāku sastopamību vispārējā populācijā (15%), kā arī tika novērota heteroplazmijas sastopamības pieauguma tendence, palielinoties pētāmo indivīdu vecumam (~23%). Interesanti, ka kontroles grupā heteroplazmija tika detektēta divās HVS-I segmenta ātri mutējošās pozīcijās (16 093 un 16 129), bet vecāko indivīdu grupā tika konstatēta vairākās (četrās) pozīcijās, divas no kurām pieder pie lēni mutējošo pozīciju grupas (16 126 un 16 354). Pēdējos gados iegūtajiem datiem par heteroplazmijas salīdzinoši augsto sastopamību dažādās populācijās piemīt liela nozīme evolūcijas pētījumos, kā arī šie fakti būtu jāņem vērā, veicot tiesu medicīnas analīzes, kas pamatojas uz mtDNS variācijām indivīdu starpā.

II. Otrās vecuma grupas raksturojums.

Līdzīgi kā augstāk minētai paraugkopai ilgdzīvotājiem tika noteikti mtDNS haplotipi un haplogrupas. 16 izanalizētie paraugi piederēja deviņām dažādām haplogrupām: H, HV, V, J, T, U2, U3, U5 un K. Biežāk sastopamas haplogrupas tika konstatētas H (31,3%) un U (37,5%), savukārt tikai vienas paraugs piederēja J haplogrupai. Sekvenējot HVS-II rajonu, mutācija 150. pozīcijā netika atrasta starp ilgdzīvotājiem. Novēroto mtDNS atšķirību iemesli starp divām vecuma grupām var būt sekojošie: mazs analizēto ilgdzīvotāju skaits (16 paraugi), ka arī ilgdzīvotāju ģenētiskās īpatnības.

Secinājumi:

1. Pliss L.,Timsa L., Puzuka A., Krumina A.,  Baumanis V., Tambets K., Villems R.

Phylogeorgaphy of mitochondrial and Y- chromosomal lineages and genetic structure of Latvians. 20^th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology. Abstracts. 2006, Kyoto Japan, p. 198.

2.  Krumina A., Pliss L.,Lazdins M.,  Baumanis V.

Genetic relationship between Latvinas and neighbouring populations, revealed by mitichondrial analysis. The FEBS Journal, 2006, v.273,S.1,p.326.

3. Pliss L., Baumanis V., Krumina A., Puzuka A.

 Mitochondrial DNA polymorphisms and heteroplasmy associated with longevity and

ageing in the Latvian population.  European conference on ageing. Abstracts. 2006, Innsbruck, Austria, p.43.

4. Pliss L, Tambets K, Loogvali E, Pronina N, Lazdins M, Krumina A, Baumanis V, Villems R.

Mitochondrial DNA portrait of Latvians: towards the understanding of the genetic structure of Baltic-speaking populations.

Ann Hum Genet. 2006 Jul;70(Pt 4):439-58.

5. Baumanis V. No Ādama līdz latviešiem. Terra, 2006,septembris-oktobris ( 45) , 12-15 lpp. (populārzinātnisks) .