Ilgdzīvotības molekulāri ģenētisko pamatu padziļināta izpēte Latvijas populācijā

V. Baumanis

• Prezentācija

Daudzos pētījumos ir pierādīta kā cilvēka, tā arī laboratorijas dzīvnieku bioloģiskās novecošanās procesu saistība ar mitohondriālās DNS (mtDNS) variabilitāti (Wallace, 2006). Organismiem novecojot, pakāpeniski palielinās mtDNS mutāciju skaits, radot heteroplazmiju – atšķirīgus indivīda mtDNS variantus. Atsevišķi iedzimti mtDNS polimorfismi ar atšķirīgu biežumu ir sastopami dažādās vecuma grupās. Iespējams, ka mtDNS variantu ietekme uz bioloģiskās novecošanās procesiem ir populācijām specifiska un ka šo ietekmi iespaido kā populācijas genofonda īpatnības, tā arī vides apstākļi.

Pētniecības projekta mērķis un darba uzdevumi 

Šī pētniecības projekta mērķis bija izpētīt Latvijai raksturīgo iedzimto mtDNS genotipu variabilitāti dažādās vecuma grupās un noskaidrot dažādu mtDNS polimorfismu ietekmi uz novecošanās procesu norisi.

Projekta uzdevumi:

1. Ieviest un pielāgot pētnieciskajai praksei mitohondriālās DNS (mtDNS) heteroplazmijas detektēšanas metodes, izmantojot „Surveyor Mutation Detection System” („mismatch-specifiskā” endonukleāze) sākotnējam skrīningam, bet turpmāk – denaturējošo gradienta gēla elektroforēzi (DGGE) un sekvenēšanas analīzi, lai apstiprinātu mtDNS heteroplazmiju;
2. Raksturot mtDNS kontroles rajona (HVS-I un HVS-II – variablo segmentu) heteroplazmijas sastopamību trīs dažādās vecuma grupās (kontroles grupas paraugiem vecumā no 18 – 40 gadiem, veco indivīdu grupas paraugiem vecumā no 74 – 89 gadiem un ilgdzīvotājiem vecumā virs 90 gadiem);
3. Noteikt un raksturot nosacīto neitrālu mtDNS polimorfismu (gan kodējošā gan nekodējošā rajona) biežumu trīs dažādās vecuma grupās (sk. 2. punktu), izmantojot RFLP metodi un nukleotīdu sekvenēšanu;
4. Veikt iegūto datu statistisko apstrādi un salīdzināt tos ar citās Eiropas valstīs veikto pētījumu rezultātiem.

Rezultāti:

Mūsu rīcībā esošā ilgdzīvotāju DNS kolekcija (indivīdi vecumā virs 90 gadiem) 2008. gada tika papildināta, un kopējais izanalizēto paraugu skaits ir 74. Savukārt, indivīdu grupā vecumā no 74 līdz 89 gadiem – izanalizēti papildus 100 paraugi. Augstāk minētie paraugi tika salīdzināti ar kontroles grupu (351 klīniski veseli 18-40 gadus veci indivīdi, latvieši trijās paaudzēs), lai atrastu iedzimto mtDNS polimorfismu variantu (haplogrupas un haplotipi), kā arī heteroplazmijas sastopamības atšķirību dažādās vecuma grupās. Kopumā projektā iekļauto dažādu vecuma grupu paraugu skaits ir 525. Divi galveni darba uzdevumi bija dažādas vecuma grupas analizēt: 1) mtDNS haplogrupu un haplotipu raksturu; 2) mtDNS heteroplazmijas biežumu.

1. mtDNS haplogrupas un haplotipi tika noteikti 174 indivīdiem no divām dažādām vecuma grupām (ilgdzīvotājiem un indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem). Visiem paraugiem tika veikta mtDNS kontroles rajona HVSI un HVSII segmenta tiešā nukleotīdu sekvenēšana. Analizējot iegūtos haplotipus, paraugi tika sašķiroti pēc to iespējamās piederības konkrētām haplogrupām. Paraugu piederība noteiktajām haplogrupām tika pārbaudīta, veicot PCR-RFLP analīzi, izmantojot 9 restriktāzes: AluI, HinfI, RsaI, NlaIII, MseI, BsuRI, BstOI, AccI un SmaI.

Balstoties uz etnisko piederību, iedzimto mtDNS variantu statistiskai analīzei (Arlequin, Excoffier et al., 2005) izmantoti 70 paraugi (latvieši) no 100 izanalizētiem vecuma grupā no74 līdz 89 gadiem un 74 ilgdzīvotāju paraugi. Izpētītie 144 paraugi piederēja deviņām dažādām Eiropas populācijām raksturīgām mtDNS haplogrupām - H, V, HV, U, I, W, X, T un J. Salīdzinot vecāko indivīdu grupas (vecumā no 74 līdz 89 gadiem) analīzē iegūtos rezultātus ar kontroles grupas (351 indivīdu vecumā no 18 līdz 40 gadiem) datiem, statistiski ticama atšķirība atklāta mtDNS haplogrupas U5a biežumā. Haplogrupa U5a indivīdu grupā vecumā no 74 līdz 89 gadiem sastopama 17,1%, bet kontroles grupā 8,0% gadījumu.

Salīdzinot kontroles grupu ar ilgdzīvotājiem statistiski ticama atšķirība vērojama starp divām haplogrupām. Ilgdzīvotāju starpā U4 haplogrupa nav sastopama, bet kontroles grupā 8,3% gadījumu, haplogrupa T* ilgdzīvotājiem sastopama 5,9%, bet kontroles grupai 1,7% gadījumu, savukārt, T2 ilgdzīvotājiem nav sastopama, kaut gan kontroles grupai – 6,3%.

Salīdzinot savā starpā indivīdus vecumā no 74 līdz 89 gadiem ar ilgdzīvotājiem statistiski ticamas atšķirības ir novērotas  starp četrām haplogrupām: ilgdzīvotājiem haplogrupa J* sastāda 7,4% un T* - 5,9%, bet indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem šīs haplogrupas netika konstatētas. Turpretim, indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem haplogrupa T2 veido 5,7% un U4 – 8,6%, ilgdzīvotājiem šīs haplogrupas nav sastopamas. Starp dažādām vecuma grupām, ņemot vērā to iedzimto mtDNS variantu sastopamību, konstatēts statistiski ticams U, T un J haplogrupu sadalījums.

Būtiski, ka līdzīgas tendences haplogrupu sadalījumā dažādās vecuma grupās ir tikušas konstatētas arī citu Eiropas valstu populāciju pētījumos. Ziemeļitālijas populācijā starp ilgdzīvotājiem J haplogrupas sastopamība ir noteikta 23%, Somijas ilgdzīvotāju vidū – 8.4%, savukārt Latvijas populācijā vecuma grupā virs 90 gadiem – 7.4%. Vidējais J haplogrupas biežums Eiropas populācijā ir ~2-6% (Niemi et al., 2003; De Benedictis et al., 2004).

Pamatojoties uz šiem datiem, var secināt, ka dažās Eiropas populācijās J haplogrupas sastopamībai pastāv tendence pieaugt, palielinoties pētāmo indivīdu grupas vidējam vecumam. Bez tam ir konstatēta vairāku citu haplogrupu saistība ar ilgdzīvošanas fenomenu, piemēram, starp Japānas ilgdzīvotājiem ir konstatēta palielināta D haplogrupas sastopamība, bet Francijas ilgdzīvotājiem – paaugstināts K haplogrupas biežums (Ivanova et al., 1998; Tanaka et al., 1998). Evolūcijas laikā, populācijām pielāgojoties noteiktiem vides apstākļiem, kā arī darbojoties ciltstēva efektam un notiekot gēnu dreifam, tajās nostiprinājās haplogrupu definējošie mtDNS polimorfismi. Bez tam mtDNS paralēli eksistē arī citi polimorfismi, kuri ir radušies salīdzinoši nesen vai arī pret kuriem nedarbojas dabiskā izlase.

Papildus mtDNS kodējošā rajona analīzei, 144 indivīdiem no divām dažādām vecuma grupām (ilgdzīvotājiem un indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem)

tika veikta arī kontroles reģiona HVSII segmenta tieša sekvenēšana. Saskaņā ar literatūrā minētajiem datiem, paaugstināts 150CT polimorfisma biežums ir ticis konstatēts gan Japānas, gan Somijas ilgdzīvotājiem. Izanalizējot iegūtās sekvences, statistiski ticamas atšķirības mutācijas 150CT sastopamība netika konstatētas starp dažādām vecuma grupām. Savukārt, salīdzinot kontroles grupu ar ilgdzīvotājiem statistiski ticamas atšķirība novērota 68CT polimorfisma sastopamības biežuma izplatībā. Ilgdzīvotāju starpā 68CT polimorfisms atrasts 4.8% gadījumā, bet kontroles grupā nav sastopams. Jāatzīmē, ka statistiski ticamas atšķirības HVSII segmenta polimorfismu sastopamībā vairāk atklātas starp kontroles grupas un indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem: 151TC, 152CT un 310TC. Turpretī, salīdzinot savā starpā indivīdus vecumā no 74 līdz 89 gadiem ar ilgdzīvotājiem statistiski ticamas atšķirības ir novērotas  starp divu polimorfismu izplatības biežumu: 152CT ilgdzīvotājiem sastopams 16.7%, bet indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem nav novērojams. Iegūtie rezultāti norāda, ka HVSII segmenta polimorfismi, kas iesaistīti mtDNS transkripcijas regulācijā, ir pietiekoši informatīvi dažādu vecuma grupu salīdzinājumā un ir populāciju specifiski.

2. Noteikta mtDNS HVSI segmenta heteroplazmijas sastopamība 40 kontroles grupas indivīdiem, 30 indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem un 30 indivīdiem vecumā virs 90 gadiem, izmantojot „Surveyor Mutation Detection System” („mismatch-specifiskā” endonukleāze), denaturējošo gradienta gēla elektroforēzi (DGGE) un sekvenēšanas analīzi.

Heteroplazmija tika atklāta sešiem kontroles grupas indivīdiem (15%), pieciem indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem (16,7%) un astoņiem ilgdzīvotājiem (26.6%). Būtiski, ka, palielinoties pētāmo indivīdu vecumam, ir novērojama tendence pieaugt ne tikai heteroplazmijas sastopamībai, bet arī pozīciju skaitam, kurās heteroplazmija tiek konstatēta. Interesanti, ka kontroles grupā heteroplazmija konstatēta divās HVSI segmenta ātri mutējošās pozīcijās (16093 un 16192), bet ilgdzīvotāju grupā – sešās pozīcijās, divas no kurām pieder pie lēni mutējošo pozīciju grupas (16304 un 16311). Pēdējos gados iegūtajiem datiem par heteroplazmijas salīdzinoši augsto sastopamību dažādās populācijās piemīt liela nozīme evolūcijas pētījumos, kā arī šie fakti būtu jāņem vērā, veicot tiesu medicīnas analīzes, kas pamatojas uz mtDNS variācijām indivīdu starpā. Agrāk tika uzskatīts, ka heteroplazmija mtDNS kontroles rajonā ir salīdzinoši reta parādība (sastopamība 2-3%) un lielākoties ir saistīta ar patoloģiskām izmaiņām. Jāpiebilst, ka pēdējos gados veiktie pētījumi norāda uz daudz lielāku heteroplazmijas biežumu dažādās populācijās un pierāda, ka heteroplazmijai var būt arī neitrāls raksturs (Tully et al., 2000, Calloway et al., 2002).

Mūsu pētniecības projekta konkrētais mērķis bija izvirzīts sekojošais: veikt iedzimto mtDNS polimorfismu raksturošanu Latvijas ilgdzīvotājiem, salīdzināt iegūtos rezultātus ar kontroles grupas paraugiem un indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem, kā arī izveidot datu bāzi ar informāciju par Latvijas ilgdzīvotāju mtDNS  ģenētiskajiem variantiem. Realizējot šo projektu, pagaidām tika savākti un izanalizēti 74 ilgdzīvotāju paraugi no 100 ieplānotiem. Kā zināms, Latvijā abu dzimumu vidējais dzīves ilgums ir 69.31 gadi, tādējādi, ilgdzīvotāju īpatsvars Latvijas populācijā sastāda nelielu daļu, neskatoties uz to, kā pēdējā laikā ilgdzīvotāju skaits Eiropas populācijās ir palielinājies. Pamatojoties uz projekta ietvaros iegūtiem datiem, būtu vēlams ilgdzīvotāju anketēšanu, paraugu vākšanu un molekulāri ģenētisku izpēti turpināt.

Secinājumi:

• Latvijai raksturīgie mitohondrialās DNS haplotipi raksturīgi Eiropas populācijai un  saskan ar literatūrā atspoguļotajiem datiem (piemēram, Somijas un Ziemeļitālijas populācijas; J, U un H haplogrupas)
• Novērotas nelielas atšķirības, kas norāda, ka mtDNS polimorfismu saistība ar novecošanos ir populāciju specifiska un ir atkarīga gan no vides faktoru ietekmes, gan no konkrētās populācijas genofonda
• Konstatēts mtDNS HVS-I segmenta heteroplazmijas biežuma pieaugums vecākās grupas indivīdiem (16,7%) un  vecuma grupā virs 90 gadiem (26,6%) salīdzinājumā ar kontroles grupu (15%)
• Palielinoties pētāmo indivīdu vecumam, pieaug arī heteroplazmiso pozīciju skaits, kas liecina par mutāciju uzkrāšanos

Neatrisinātie uzdevumi un turpmākie plāni:

• Atrast mtDNS mutāciju korelāciju ar noteiktiem bioķīmiskiem un bioenerģiskiem rādītājiem (fenotipisko īpašību raksturošana)
• Noteikt  heteroplazmijas biežumu mtDNS nekodējošā rajonā HVS-II segmentā dažādās vecuma grupās
• Atrast populācijai specifisko mtDNS polimorfismu saistību ar novecošanos/ilgdzīvotību, ņemot vērā Latvijas etnoģenēzes ģenētisko daudzveidību
• Izpētīt ilgdzīvotājiem raksturīgo mtDNS “klusējošo” jeb sinonīmo mutāciju ietekmi uz mitohondriālā genoma stabilitāti, gēnu ekspresiju un  OXPHOS komponentu sintēzi

Publikācijas:

1. Krumina A., Pliss L., Zeltina A., Baumanis V. Mitochondrial DNA coding and control region polymorphisms associated with a prolonged life span in the Latvian population (2007). ESHG Journal, vol. 15 (S1), 298.
2. Krumina A., Pliss L., Brakmanis A., Baumanis V. Mitochondrial DNA  polymorphism and its association with longevity in the Latvian population (2007). ASHG Journal, abstract, p. 269.
3. Pliss L., Baumanis V., Krumina A., Tambets K., Villems R. Phylogenetic analysis of the predominant mtDNA variant, haplogroup H (2007). FEBS Journal, vol. 274 (S1), 285.