Projekta nosaukums: "Laika izšķiršanas autofluorescences metodoloģija ādas vēža neinvazīvai diagnostikai."

Projekta nosaukums angliski: “Time-resolved autofluorescence methodology for non-invasive skin cancer diagnostics.”

Projekta līguma numurs:  1.1.1.2/VIAA/1/16/014

Projekta vadītāja: Dr. fiz. Aleksejs Ļihačovs

Projekta sadarbības partneri:

  • Vytautas Magnus Universitāte, Bioloģijas nodaļa, Biofizikas pētījumu grupa (Department of Biology, Vytautas Magnus University), Kauņa, Lietuva.

  • Starptautiskais Lāzeru Centrs (International Laser Centre), Bratislava, Slovākija.

  • Gēteborgas Universitāte, Ādas Izpētes Centrs, ķīmijas un molekulāras bioloģijas nodaļa (SkinResQU, Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg), Gēteborga, Zviedrija.

Projekta īstenošanas termiņš: 36 mēneši (1.01.2018. līdz 31.12.2020.)

Projekta kopējais finansējums: 133 805, 88 EUR

ERAF finansējums: 113 734,99 EUR 

Valsts budžeta finansējums: 13 380,58 EUR 

LU finansējums: 6 690,31 EUR

Projekta mērķis: Izstrādāt rentablu, inovatīvu, neinavazīvu metodoloģiju ādas vēža agrīnai diagnostikai un kontrolei. Diagnostisko procesu veidos audu kvantitatīvs un kvalitatīvs bioķīmiskās un fizioloģiskās funkcijas novērtējums, kombinējot lāzera ierosinātas autofluorescences (AF) sabrukšanas un AF fotoizbalēšanas metodes.

Projekta rezultāti: 2 oriģināli zinātniskie raksti ar augstu citēšanas indeksu, 4 konferenču tēzes, 1 populārzinātnisks raksts, 3 mobilitātes braucieni un zinātniskās tīklošanās.

Atsauce publicitātei (acknowledgement for publications): This work has been supported by European Regional Development Fund project “Time-resolved autofluorescence methodology for non-invasive skin cancer diagnostics” (No. 1.1.1.2/16/I/001, agreement No. 1.1.1.2/VIAA/1/16/014).

1. ceturksnis (01.01.2018- 31.03.2018)

Projekta uzsākšana un darba plāna pielāgošana jaunajam projekta uzsākšanas datumam. Līguma grozījumu sagatavošana. Projekta pirmais mēnesis tika uzsākts ar literatūras pētījumiem par tēmu kas ir saistīta ar projektu, proti – fluorescences fotoizbalēšanas mehānismi, reaktīvo skābekļa formu ģenerācija nepārtraukta optiskā starojuma ietekmē, autofluorescences kinētika nepārtrauktā ierosmē, ādas vēža optiskās diagnostiskās metodes un datu apstrāde un citi. Ir uzsākts darbs ar LU ASI esošo TCSPC (time correlated single photon counting) iekārtu, konkrēti uzsākts darbs ar mērķi uzlabot esošo metodi ādas fluorescences dzīves laika un fotoizbalēšanas parametru vienlaicīgai reģistrācijai.Tika novērtēta ietekme uz fotoizbalēšanas parametru aprēķinu atkarībā no laika vārtiem kas tiek subjektīvi izvelēti no fluorescences sabrukšanas sadalījuma. Ir veikti mērījumi lai atrastu optimālus parametrus in-vivo ādas autofluorescences dzīves laika un fotoizbalēšanas parametru reģistrācijai. Tiek pārbaudīta TCSPC iekārtas iespējas veikt atkārtotus mērījumus ar lielu atkārtošanas frekvenci (>10E-3-7 sek.). Papildus tām, tiek veikti ierīces testi izmantojot šaurjoslas filtrus, platjoslu filtrus un monohromātoru. Tika uzsākts darbs pie datu apstrādes skriptu izstrādes, lai varētu veikt rezultātu apstrādi un iegūtu sekojošus parametrus – fluorescences dzīves laiks, fotoizbalēšanas parametri un fluorescences intensitātes izmaiņas īsi pēc ierosmēs.

2. ceturksnis (01.04.2018- 30.06.2018)

Atskaites periodā tika veikta metodoloģijas pilnveidošana ādas lāzeru ierosinātas autoflurescences dzīves laika un fotoizbalēšanas parametru vienlaicīgai reģistrācijai. Tika pilnveidoti esošie datu apstrādes algoritmi, konkrēti tika uzlabota reģistrācijas laika izšķiršana. Tika piedāvāti inovatīvi datu apstrādes algoritmi, kas ļauj apskatīt ierosinātas autoflurescences parametrus (ierosinātā stāvokļa dzīves laiks, amplitūdas, fotoizbalēšanas ātrums) atkarībā no reģistrācijas laika vārtiem (time gate). Šāda pieeja ļauj reģistrēt neatkarīgus dinamiskus procesus, piemēram, dažādu dabisku fluoroforu autofluorescences parametrus. Konstatēts, ka veicot eksperimentus in-vivo uz cilvēka ādas, autoflurescences fotoizbalēšanas kinētikas dažādos laika vārtos ir atšķirīgas, kas netiešā veida raksturo ādas dabisko fluoroforu koncentrācijas un foto-ķimiskus procesus. Savukārt, gadījumos, kad kinētikas ir vienādas, tad rezultējošā kinētika tiek labi aprakstama ar mono eksponenciālu piedzīšanu. Šī fakts iespējams netiešā veidā liecina par dabisko fluoroforu skaitu, vai par atšķirīgiem foto-ķīmiskiem procesiem.Papildus tad tika veikti fotoizbalēšanas eksperimenti izmantojot post-mortal cūkas ādu. Konstatēts ka pēc lāzera izslēgšanas autofluorescences intensitāte neatjaunojas, bet turpina samazināties. Šīs rezultāts savukārt liecina par ķīmisko procesu kurš turpinās arī pēc lāzera izslēgšanas. Šajā periodā tika realizēts mobilitātes brauciens uz Vytautas Magnus Universitāti, Bioloģijas Nodaļu lai realizētu projekta uzdevumu T1.2. Mobilitātes laikā vairāku diskusiju (tīklošanās) rezultātā tika izstrādāts eksperimenta plāns lai noteiktu iespējamo korelāciju starp autoflurescences fotoizbalēšanas parametriem un brīvo radikāļu identificēšanu šūnu līmeni. Pieņemošā puse nodemonstrēja eksperimentu ar eksogēno sensibilizējošu vielu klātbūtni un to izraisīto foto-ķimisku reakciju ar turpmāko singlēta skābekļa ģenerāciju. Tika uzsākts darbs pie metodoloģijas izstrādes skābekļa aktīvo formu noteikšanai in-vitro.

3. ceturksnis (01.07.2018- 30.09.2018)

Atskaites periodā tika turpināta metodoloģijas pilnveidošana ādas lāzeru ierosinātas autoflurescences dzīves laika un fotoizbalēšanas parametru vienlaicīgai reģistrācijai. Tika realizēts vel viens mobilitātes brauciens uz Vytautas Magnus Universitāti, Bioloģijas Nodaļu lai realizētu projekta uzdevumu T1.2. Mobilitātes laikā vairāku diskusiju rezultātā tika izstrādāts eksperimenta plāns, atlasīti vajadzīgi reaģenti, šūnu kultūras, ierosmes un detektēšanas viļņa garumi. Tika izstrādāta mērījumu stratēģija lai korekti detektētu autofuorescences parametrus no šūnām un fluorescences emisijas parametrus no SOSG sensora. Rezultātā tika iesniegta konferenču tēze: Alexey Lihachev, Mindaugas Tamošiūnas, Saulius Šatkauskas, Vanesa Lukinsone, and Ilze Lihacova. Generation of reactive oxygen species during autofluorescence photobleaching in-vitro. Int. Conf. Laser Applications in Life Sciences (LALS) 2018.Tika turpināts darbs pie iekārtas sagatavošanas fluorescences dzīves laika un fotoizbalēšanas mērījumu veikšanai. Konkrēti, tika piemeklēti optiskie filtri un ierosmes viļņa garumi kas atbilst SOSG sensora absorbcijas joslai un fluorescences emisijas spektram. Nopublicēta tēze “Northern Optics 2018” konferences materiālos: Janis Spigulis, Uldis Rubins, Edgars Kviesis-Kipge, Andris Grabovskis, Aleksejs Lihacovs, Ilze Lihacova, Dmitrijs Bliznuks, Ilona Kuzmina, Ilze Oshina, Marta Lange. Advanced imaging technologies for distant assessment of in-vivo skin. Northern Optics & Photonics 2018, 12-14 September 2018, Conf. Proc., pp. 94. Pieejama:
photonicsweden.org/wp-ontent/uploads/NorthernOptics2018_proceedings.pdf

4. ceturksnis (01.10.2018- 31.12.2018)

Ir veikti fluorescences fotoizbalēšanas un sabrukšanas kinētikas paralēlie mērījumi izmantojot dažādu viļņu garumu lāzerus fluorescences ierosmei. Laika posmā no 08-19.10 notika komandējums uz Oulu Universitāti ar mērķi apmeklēt Optoelektronikas un mērījumu tehnikas (Optoelectronics and measurement techniques laboratory) laboratoriju, Igor Meglinski vadībā. Tika veikta tīklošanās ar Oulu Universitātes zinātniekiem. Komandējuma laikā tika apmeklēta laboratorija, apskatīti dažādi veikto eksperimentu darba galdi un optisko procesu simulācijas platforma (http://www.biophotonics.fi/).Zinātniskās tīklošanās laikā apspriedām pētnieciskās tendences un prioritātes biofotonikā. Definējam sinerģiskās pētniecības jomas ar mērķi nākotnē piesaistīt ārējo finansējumu kopīgi piedaloties Eiropas projektu konkursos. Tika veikti optisko procesu (autofluorescences kinētikas simulācija ādas slāņos) simulācijas testi izmantojot Oulu Universitātes zinātnieku izstrādāto platformu. Sadarbība ar projekta partneriem (Vytautas Magnus University) tika izveidots mērījumu protokols (D1.1) lai pārbaudītu projekta izvirzītu hipotēzi - audu/šūnu dabiskas fluoroforas darbojas kā optiskā starojuma akceptori, kuri izraisa skābekļa aktīvo formu ģenerāciju fotosensibilizācijas procesā. Ir iegūti šūnu un SOSG fluorescences spektrālie dati.Veicot eksperimentos esmu saskaries ar vairākām problēmām un neviennozīmīgiem rezultātiem kuriem ir nepieciešama interpretācija. Ir konstatēts, ka in-vitro šūnas izstaro dabisku autofluorescenci, kurai spektrālās īpašības, jeb spektrs pārklājās ar SOSG sensora fluorescenci. Analizējot steady state spektrus, nav iespējams atšķirt šūnu autofluorescenci no SOSG fluorescences. Lai atrisinātu šo problēmu, tika sagatavots eksperiments, kur papildus tika analizēts fluorescences ierosinātā stāvokļa dzīves laiks. Ir zināms, ka šūnu dabiskas fluorescences sabrukšana ir aprakstāma ar diviem/trijiem procesiem kur katru procesu var raksturot ar dzīves laiku (~ 0.4 ns, 1.2 ns, 7 ns). Turpretī SOSG fluorescences sabrukšanas laiks ir sagaidāms ar garāku dzīves laiku ~10 ns. Tomēr, veicot literatūras pētījumus netika atrasts SOSG raksturojošais dzīves laiks. Ka arī ir konstatēts, ka SOSG ir nestabila viela (notiek fotoizbalēšana apstarojuma laikā), līdz ar to notiek fluorescences intensitātes samazināšanas un fluorescences sabrukšanas sadalījuma izmaiņas. Tie visi ir dinamiskie procesi kuri ietekme SOSG dzīves laiku. Šobrīd ir nepieciešams veikt eksperimentu lai neteiktu SOSG fluorescences dzīves laiku intervālus pie konkrētiem optiskā starojuma parametriem (jauda, doza).

5. ceturksnis (01.01.2019- 31.03.2019)

Janvārī tika aprobēts ādas autofluorescences kinētikas datu apstrādes algoritms. Tika piedāvāts  empīrisks algoritms kas apstrādā autofluorescecnes intensitātes izmaiņas un aprēķina fotoizbalēšanas parametrus. Algoritms tika aprobēts uz klīniskiem datiem kuri tika iegūti sadarbībā ar ERAF 1.1.1.1#197 projektu. Konkrēti, tika analizēti RGB ādas patoloģiju autofluorescences secīgie attēli 405nm ierosmē. Rezultāti tika apkopoti un iesniegta konferenču tēze ECBO konferencei. Konferenču tēze tiks publicēta SPIE Proc tēžu krājumos, kas ir indeksēts SCOPUS datubāzē.

Tika veikti endogenu fluoroforu fluorescences emisijas kinētikas ar ārēji pievienotu singlēta skābekļa sensoru (SOSG). Pētījuma tika izmatoti in-vitro Me45 melanomas šūnas. Tika veikti šūnu fluorescences kinētikas testi izmantojot 405 nm lāzera ierosmi. Pētījumā laikā ir konstatēts, ka nepārtrūktā 405nm lāzera ierosmē šūnu autofluorescences intensitāte samazinās eksponenciāli. Turpretī pievienota SOSG sensora fluorescences intensitāte eksponenciāli pieaug. Iegūtie dati liecina par singlēta skābekļa izveidi fotoizbalēšanas procesā šūnu līmenī. Iegūtie rezultāti apstiprina projekta izvirzīto hipotēzi, ka endogenas fluoroforas pārnes absorbēto enerģiju skābeklim un pārveidojot to par skābekļa radikāli. Papildus tam, tika veikti singlēta skābekļa mērījumi optiskā starojumā un ultraskaņas ietekmē in-vitro. Par iegūtiem rezultātiem tika iesniegta konferenču tēze DOC RIGA 2019 konferencei. Tīklošanas rezultātā ar Vytautas Magnus Universitātes pētniekiem tika atlasīti papildus skābekļa radikāļu sensori kuri tiks izmantoti lai precīzāk noteikt iespējamos procesus optiskā starojuma ietekmē.

Tika turpināts darbs pie in-vitro šūnu autofluorescence spektru datu apstrādes. Sadarbībā ar Vytautas Magnus Universitātes pētniekiem veicu endogenu fluoroforu fotoizbalēšanas mērījumus ar mērķi identificēt fluorescences kinētikas korelāciju  ar šūnu metabolisko aktivitāti un hipoksiju. Laika posmā no 24-29 veicu tīklošanu ar Bulgārijas zinātniekiem. Prezentēju savu pēcdoktorantūras projektu E.D. Elektronikas institūta seminārā. Komandējuma laikā saņēmu konsultācijas par ādas endogēnu fluorescenci UV/VIS ierosmē. Tika veikti fluorescences mērījumi izmantojot ex-vivo ādas pataloģijas 405 nm un 785 nm lāzeru ierosmē. Veicu ex-vivo ādas patoloģiju fluorescences datu apstrādi.

6. ceturksnis (01.04.2019- 30.06.2019)

Laika posmā no 07.04 līdz 12.04 mobilitātes brauciena ietvaros apmeklēju Starptautisko Lāzeru Centru (Bratislava, Slovākija). Mobilitātes laikā prezentēju savu postdok projektu ILC (International Laser Centre) seminārā. Mobilitātes laikā esmu iepazīstināts ar ILC pētnieciskajām iekārtam un to iespējam veikt spektrālus un ar laika izšķiršanu mērījumus un rezultātu analīzi. Tīklošanās laikā tika apspriests projekta mērķis un tika izvirzītas vairākas hipotēzes ka arī sastādīti eksperimentu protokoli. Mobilitātes laikā tika veikti fluorescences mērījumi ar laika izšķiršanu izmantojot dažādus paraugus (izolētas fluorescējošās molekulas, ex-vīvo cūkas āda). Tika uzņemti autofluorescecnes dzīves laika un fotoizbalēšanas kinētikas, ka arī tika apskatīta autofluorescences atjaunošanas pēc fotoizbalēšanas. Uzņemti fluorescējošu molekulu fluorescences sabrukšanas un fotoizbalēšanas kinētikas dažādu ārēju faktoru ietekmē. Mērījumos tika izmantots CLSM (confocal laser scanning microscope) un TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) iekārtas. Laika posma no 15.04 līdz 30.04 veicu iegūto datu apstrādi. Laika posmā no 01.05 līdz 06.05 veicu endogēnu fluoroforu fluorescences spektru apstrādi. Ikgadējais atvaļinājums no 07.05.2019 līdz 16.05.2019 un no 20.05.2019 līdz 02.06.2019. 17 maijā prezentēju projekta rezultātus LU Tehnoloģiju dienā. Jūnijā veicu fotoizbalēšanas algoritma validāciju izmantojot ādas pataloģiju autofluorescences attēlus, kuri ir iegūti 405nm LED ierosmē. Algoritma validācijas rezultāti tika apkopoti stenda referātā. Laika posmā no 23.06.2018 līdz 27.06.2019 apmeklēju Eiropas Biomedicīniskās Optikas konferenci (ECBO 2019, Minhene, Vācija) un prezentēju stenda referātu “Imaging of LED-excited autofluorescence photobleaching rates for skin diagnostics”.

 

Pēdējās izmaiņas veiktas