Populārzinātniska informācija par Projekta LU13 (2003) “Ērlihiozes un ērču encefalīta izsaucēju  molekulārā bioloģija” rezultātiem

Projekta vadītāji: Prof. Viesturs Baumanis (Bioloģijas fakultāte), Prof. Aija Žilēvica (Medicīnas fakultāte)

Pēdējās desmitgades izmaiņas lauksaimniecībā izraisījušas ievērojamu ērču aktivitātes pieaugumu Latvijā. Līdztekus šim aktivitātes pieaugumam, pieaugusi arī saslimstība ar ērču pārnēsātām slimībām. Latvijā jau tiek pētīts Laima boreliozes izraisītājs un Sabiedrības veselības aģentūra sadarbībā ar Zviedrijas Infekcijas slimību kontroles institūtu ierobežotā  mērā veikusi ērču  encefalīta (TBE) vīrusu   molekulāro tipēšanu. Tad tika parādīts, ka vismaz ērču encefalīta vīrusi (TBEV) Latvijā nav vienādi. Tādus pētījumus var veikt tikai ļoti ierobežotā apjomā, jo tie prasa vīrusu kultivēšanu (parasti peļu smadzenēs, ko Latvijā nedara). Tādēļ pašreiz šādi pētījumi nenotiek , bet attiecībā uz ērlihijām nekādi pētījumi Latvijā līdz šim nav vispār nebija veikti (ir zināms, ka Zviedrijā ~ 5% ērču ir inficētas ar ērlihijām).

Projekts paredzēja apsekot divu gadu laikā dažādos Latvijas rajonos ērču populācijas  inficētību ar ērlihijām un līdztekus arī ar encefalīta vīrusu.

2003.gadā veikta ērču  encefalīta vīrusa detektēšana  ar reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakcijas (RT-PCR) palīdzību un tika izmantota  5’NCR (5’gala nekodējošā rajona ) un NS5 proteīna kodējošā rajona fragmentu amplifkācija. Tika pārbaudīts metožu specifiskums un jutība, kā pozitīvās kontroles izmantojot  dažādu  ērču encefalīta inaktivētu  vakcīnu celmus. Ar 5'NCR RT PCR metodi tika iegūts pareizā garuma amplikons,  nosekvenēts un salīdzināts ar GenBank datubāzi, kas pierādīja metodes specifiskumu. Metožu jutība tika noteikta 5’NCR fragmenta amplifikācijas gadījumā vidēji 10,45 TBE vīrusa  daļiņas ,jeb 9,8 fg RNS paraugā , bet 5NS-RT-PCR metode izrādījās 100 reizes nejutīgāka. (pozitīva atbilde tika iegūta tikai ar 980 fg TBEV RNS.

Izmeklējamajos ērču un slimnieku asins paraugos salīdzinājumam  veica  arī vīrusa detektēšanu ar imunoenzimātiskajām metodēm (ELISA). Vairākos gadījumos novēroja  negatīvu amplifikācijas  rezultātu pie pozitīvas ELISA, jo sevišķi  analizējot uzglabātus paraugus. Tas norāda uz virālās RNS nestabilitāti , apgrūtina ELISA  un RT-PCR pielietošanu vienam paraugam un prasa tā speciālu sagatavošanu attiecīgām manupulācijām.

Kopumā tika analizēti 12 Ixodes ērču grupu paraugi, kas tika vākti dažādos Latvijas rajonos (60 ērces, pa 5 vienā grupā). 7 no 12 ērču grupām bija pozitīvas pēc 5’NCR metodes, 3 no 12 bija pozitīvas pēc NS5 metodes. Atsevišķi amplikoni tika nosekvenēti un to secības salīdzinātas ar GenBank datu bāzi. Šie dati apstiprināja amplikonu specifiskumu un ļāva izteikt hipotēzes par detektēto vīrusu genotipiem, kuri šķiet tuvāki rietumeiropā   sastopamajiem ērču genotipiem. Pēdējais novērojums papildus pamato Latvijā pašreiz plašāk lietotās vakcīnas, kura izgatavota no K23 rietumu subtipa lietošanas lietderību, kaut gan ari citas lietotās vakcīnas ir efektīvas.

No 8 TBE slimieku asins plazmas paraugiem, izolējot TBEV RNS ar QIAamp Viral RNA Mini kita palīzību un izmantojot 5’NCR RT PCR metodi, pozitīvi bija 2 paraugi, taču amplikonu sekvenču identitāte dod pamatu šaubām par iespējamu kontamināciju kādā no paraugu apstrādes stadijām. Tomēr, amplikonu iegūšanas iespēja no TBE slimnieku asinīm parāda iespēju pētīt virēmiju, saistīt to ar klīniskās formas smagumu un tālāk raksturot  vīrusu genotipu.

Izmeklēti 404 ērču paraugi uz ērlihijām, kurās kopā atrasti 11  pozitīvi  paraugi, kuri detektēti ar divpakāpju (nested) poliemrāzes ķēdes reakciju amplificējot 16S rRNS gēna attiecīgi 932 un 546 nukleotīdus garus fragmentus. Diviem paraugiem veikta  sekvences analīze un parādīta homoloģija ar Erlichia sp. Frankonia un phagocytophila genosugām. Tātad pirmo reizi Latvijā parādīta ērču inficētība ar ērlihijām (~ 3%) , bet to  taksonomiskam raksturojumam nepieciešami  papildus pētījumi.  Erlihijas  atrada  Ixodes ricinus , bet ne persulcatus ērcēs.

Informācija no Valsts infektoloģijas centra norāda par iespējamu cilvēku saslimšanu ar erlihiozi, kura līdz šim Latvijā nav  diagnosticēta . Erlihiozes ir neizpētītas slimības, un pirmos saslimšanas gadījumus cilvēkiem reģistrēja pirms apmēram desmit gadiem , un slimības klīniskajā ainā  novēro asins sastāva izmaiņas, kas klīnikā tiek bieži reģistrētas. Iespējams, ka šādos gadījumos erlihiozes vienkārši netiek pamanītas.  Mūsu pētījuma rezultāti ļauj ieteikt saslimšanu gadījumos pēc ērču koduma, ja netiek apstiprināts ne encefalīts, ne laima borelioze, ar PCR palīdzību detektēt iespējamu  erlihiozi un veikt attiecīgus novērojumus un terapiju.

Galvenie rezultāti publicēti:

Bormane A., Zeltiņa A., Lucenko I., Mavčutko V., Duks A., Pujate E., Ranka R., Baumanis V. – Tick-born encephalytis – pathogen, vectors and epidemiological situation in Latvia 2002-2003. Acta Universitatis Latviensis, 2004,Vol.676,pp.27-37

Projekta prezentācija